잔류 숙주 세포 DNA 위험 평가

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생물학적 제제는 박테리아, 효모, 동물 세포 및 연속 세포주의 숙주로부터 발현된다. 생물학적 생성물이 세포 기질로부터 생성되기 때문에, 잔류 숙주 세포 DNA가 최종 생성물에 존재하는 것은 불가피하다. 통과 세포주에서 종양 또는 바이러스 관련 유전자로 인해 면역원성, 종양원성 및 감염성의 잠재적 위험이 있습니다. 잔류 DNA는 잠재적인 높은 안전성 위험을 가지며, 중요한 품질 속성으로 간주된다. WHO, EU 및 FDA를 포함한 현재 기관은 허용되는 잔류 DNA 양 (10 ng 또는 100 pg/용량 미만) 을 제한했습니다. 잔류 DNA를 검출하는 방법 중, qPCR은 민감도, 정확도, 정밀도 및 시간 절약으로 인해 잔류 DNA 정량화에 가장 실용적이라고 생각된다.

RDNA는 다양한 숙주에서 나올 수 있기 때문에 rDNA는 다양한 크기와 물리적 형태로 존재할 수 있습니다. DNA 함량과 크기의 다른 한계는 과학적 증거와 강력한 위험 평가에 의해 뒷받침되는 경우 규제 기관이 수용 할 수 있습니다. 숙주 세포 DNA 잔차 수준은 제품 일관성 및 품질 관리의 지표로 작용할 수 있습니다. 잔류 DNA를 검출하면 생산 배치 사이의 일관성이 보장되고 제품 품질 평가에 대한 참조가 제공됩니다.

샘플 추출 요구 사항

숙주 세포 DNA 농도 및 크기 분포를 분석하기 위해, 샘플 매트릭스로부터의 억제 화합물 없이 검출을 보장하기 위해 먼저 샘플로부터 DNA 분획을 추출한다. 마그네틱 비드 분리는 이러한 목적으로 가장 일반적으로 사용되는 기술로 처리량과 정밀도를 증가시키는 자동화 된 추출 프로세스를 가능하게합니다.

잔류 숙주 세포 DNA의 추출 효율을 결정하기 위해, 공지된 양의 표적 DNA ('스파이크') 를 추출 전에 샘플에 첨가한다. 추출 후 측정된 DNA 양을 스파이크된 양과 비교함으로써, 추출 효율이 계산될 수 있다. 그 후, 이 효율 값은 샘플 내의 잔류 숙주 세포 DNA를 결정하는데 사용된다. 추출 효율의 감소는 핵산과 함께 공동 추출된 억제 화합물의 존재를 나타낸다.

잔류 숙주 세포 DNA 분석의 검증

실시간 PCR을 사용하여 숙주 세포 DNA에 대해 매우 민감하고 특이적인 검출 방법을 개발하려면 신중한 프라이머 설계 및 PCR 반응 최적화가 필요합니다. 의 특이성과 감도실시간 PCR어닐링 온도, 시간, 및 반응 완충액 내의 양이온 및 프라이머의 농도에 의해 영향을 받는다. 다중 카피에 존재하는 유전자를 표적화하면 분석 민감도를 증가시킬 수 있다.

분석 방법의 선형성 및 범위는 표준 곡선의 회귀선을 계산함으로써 평가되었다. 3 개의 상이한 농도에서 스파이크 DNA 표준의 회수율을 분석함으로써 정확도를 평가하였다. 각 수준에서 모든 QC의 % CV를 통해 분석 내 및 분석 간 정밀도를 평가하였다. 감도는 LOD 및 LLOQ를 체크함으로써 결정되었다. 특이성은 관련 종/균주로부터 추출된 DNA 샘플 또는 매트릭스 DNA 풀을 분석함으로써 평가되었다. 상이한 저장 조건 하에서 분석 성능의 안정성을 평가함으로써 견고성을 평가하였다.

잔류 숙주 세포 DNA 분석의 검증 범위는 다음과 같습니다.